L’ossigeno svolge due ruoli nell’organismo. Il primo è quello di substrato: accetta elettroni alla fine della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale, rendendo possibile la fosforilazione ossidativa e la produzione di ATP. Il secondo è quello di segnale: i livelli di ossigeno regolano l’espressione genica, il comportamento cellulare e il tono vascolare attraverso percorsi che coinvolgono i fattori inducibili dall’ipossia, le specie reattive dell’ossigeno e le specie reattive dell’azoto, cioè ROS e RNS.

La medicina clinica tradizionale si concentra quasi esclusivamente sul ruolo di substrato. L’ossigenoterapia iperbarica, HBOT, è interessante proprio perché sfrutta entrambi i ruoli. Portando transitoriamente i tessuti in iperossia, fa qualcosa che va ben oltre il rifornimento della coda di produzione di ATP: attiva cascate di segnalazione i cui effetti a valle persistono ben oltre la fine della sessione.

Questa distinzione è la colonna vertebrale dell’articolo. La storia del substrato è fisica consolidata, pienamente compresa, clinicamente provata per indicazioni specifiche e incontrovertibile. La storia della segnalazione è biologia reale, meccanisticamente stabilita in colture cellulari e modelli animali, con una traduzione clinica genuina per alcuni esiti e contestata per altri. Le affermazioni sulla longevità e sulla cognizione che hanno generato il maggiore interesse popolare si collocano in un terzo livello: biologicamente plausibili, fondate su meccanismi reali, ma sostenute da una base di trial clinici piccoli, spesso non in cieco e concentrati in un unico ecosistema di ricerca.

Il lettore deve sapere in quale livello si trova in ogni momento. Questo articolo lo indica esplicitamente.

Livello 1: Fisiologia consolidata

La legge di Henry afferma che la quantità di un gas disciolto in un liquido è proporzionale alla pressione parziale di quel gas sopra il liquido. A livello del mare, respirando aria ambiente, la pressione parziale dell’ossigeno è di circa 160 mmHg e la quantità disciolta direttamente nel plasma è di circa 0,3 vol%: una frazione trascurabile dell’ossigeno totale trasportato, poiché il resto è gestito dall’emoglobina. In condizioni normali non è un problema, perché l’emoglobina è già quasi satura.

In condizioni iperbariche la fisica cambia sostanzialmente. A 2,4 ATA respirando ossigeno al 100%, l’ossigeno disciolto nel plasma può superare i 6 vol%, circa venti volte la baseline al livello del mare. Si tratta di una quantità clinicamente significativa: è sufficiente a sostenere l’ossigenazione tissutale anche senza globuli rossi, perché il plasma da solo è in grado di fornire abbastanza ossigeno se la circolazione è intatta.^[1]

Questo meccanismo, l’ossigeno disciolto che aggira l’emoglobina e raggiunge il tessuto ischemico per diffusione plasmatica, è la base fisica delle indicazioni più solide per l’HBOT. Nella malattia da decompressione, le bolle di azoto ostruiscono il flusso microvascolare e devono essere fisicamente compresse; il caricamento aggiuntivo di ossigeno accelera il riassorbimento delle bolle e mantiene la vitalità tissutale durante il processo. Nell’avvelenamento da CO, l’emoglobina è occupata dal monossido di carbonio, il che ne azzera di fatto la capacità di trasportare ossigeno; portare la PO2 plasmatica a livelli iperbarici mantiene l’ossigenazione tissutale attraverso una via che non dipende dall’emoglobina. Nelle ulcere del piede diabetico e in altre ferite ischemiche, il margine della ferita è ipossico non a causa di CO o azoto, bensì perché la vascolarizzazione locale è insufficiente; aumentare l’ossigeno plasmatico disciolto raggiunge il tessuto per diffusione su distanze più brevi rispetto a quelle normalmente necessarie.

Niente di tutto ciò è ipotesi. Il meccanismo della legge di Henry è fisica. Il beneficio clinico in queste specifiche indicazioni ne deriva attraverso una catena logica diretta, supportata da trial controllati randomizzati. La fisiologia è compresa. L’ingegneria della somministrazione è compresa. Questo è il livello consolidato.

Livello 2: L’ossigeno come segnale

Qui il quadro diventa più interessante e più complesso.

La biologia cellulare della rilevazione dell’ossigeno è ben stabilita. Il Premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina 2019 è stato assegnato a William Kaelin Jr., Peter Ratcliffe e Gregg Semenza per aver caratterizzato il percorso HIF: in particolare, come le cellule percepiscono i livelli di ossigeno e vi si adattano. HIF-1alpha è un fattore di trascrizione prodotto continuamente nelle cellule che, in condizioni di ossigeno normale, viene continuamente degradato da una famiglia di enzimi prolil-idrossilasi che richiedono ossigeno per funzionare. Quando l’ossigeno cala, l’attività della prolil-idrossilasi diminuisce, HIF-1alpha si accumula e si attiva un ampio programma di espressione genica, che include i geni per VEGF, eritropoietina e gli enzimi di adattamento metabolico.

L’iperossia spinge questo processo nella direzione opposta: i livelli elevati di ossigeno accelerano la degradazione di HIF-1alpha. Ma è nella riossigenazione, la transizione dall’iperossia alla normale tensione di ossigeno, che gli effetti di segnalazione dell’HBOT cominciano ad avere senso biologico.

Durante e dopo una sessione iperbarica, la transizione di riossigenazione genera un’esplosione di ROS e RNS. ROS e RNS non sono semplicemente segnali di danno; a concentrazioni controllate sono veri e propri secondi messaggeri. Gli eventi molecolari specifici documentati in letteratura includono l’upregolazione di VEGF, l’attivazione dell’ossido nitrico sintasi endoteliale, eNOS, e la mobilizzazione dal midollo osseo in circolo di cellule staminali e progenitrici CD34-positive. Quest’ultimo effetto è stato caratterizzato in soggetti umani: Thom e colleghi hanno misurato le conte di cellule CD34+ prima e dopo sessioni HBOT, riscontrando aumenti di circa otto volte nelle cellule progenitrici circolanti rispetto ai controlli che respiravano aria ambiente a pressione normale.^[2]

Il quadro integrativo proposto è il «paradosso iperossico-ipossico», articolato da Hadanny ed Efrati: l’iperossia intermittente seguita dal ritorno alla normossia crea un’oscillazione redox che mima, a livello di segnalazione, gli effetti del precondizionamento ipossico.^[3] Il precondizionamento ipossico è un fenomeno ben caratterizzato: brevi periodi di ischemia prima di un evento ischemico maggiore riducono il danno successivo, in parte attraverso l’attivazione del percorso HIF e in parte attraverso il condizionamento mitocondriale. L’ipotesi HBOT è che le conseguenze della segnalazione della transizione da iperossia a normossia siano funzionalmente analoghe, ottenute però dalla direzione opposta.

La pretesa meccanicistica merita un’affermazione chiara del grado di fiducia. Il percorso di rilevazione dell’ossigeno è biologia Nobel consolidata. Il ruolo di secondo messaggero di ROS e RNS è ben stabilito in vitro e in modelli animali. La mobilizzazione di cellule staminali da parte dell’HBOT è stata dimostrata negli esseri umani. Non si tratta di affermazioni speculative.

Ciò che è incerto è l’entità di questi effetti negli esseri umani con protocolli clinici, quanto la segnalazione a valle si traduca in esiti clinici misurabili, e quali esiti siano significativamente influenzati e in che misura. Il meccanismo è reale. La conseguenza clinica del meccanismo, in popolazioni umane specifiche con protocolli specifici, è il punto su cui la scienza sta ancora trovando risposta.

Una precisazione su una metafora popolare: si sostiene a volte che «l’ossigeno che sfugge quando si esce dalla camera è ciò che fornisce il segnale». Si tratta di una descrizione approssimativa dell’oscillazione redox di riossigenazione. La biologia effettiva è più specifica: la transizione dalla pressione parziale elevata a quella normale modifica lo stato redox nelle cellule, generando ROS e RNS che innescano risposte trascrizionali, compresa la riattivazione del percorso HIF. La metafora non sbaglia nell’indicare la transizione come l’evento chiave, ma oscura il meccanismo reale, che è elettrochimico e non riguarda semplicemente il gas che fuoriesce.

Livello 3: Esiti clinici con prove di grado RCT

La Undersea and Hyperbaric Medical Society, UHMS, mantiene un elenco di indicazioni approvate, aggiornato periodicamente, che rappresenta il consenso della medicina iperbarica su dove le evidenze siano sufficienti a giustificare il trattamento. Le indicazioni approvate comprendono: malattia da decompressione, avvelenamento da CO, embolia gassosa arteriosa, mionecrosi clostridiale (cancrena gassosa), trauma da schiacciamento e ischemia traumatica acuta, infezioni necrotizzanti dei tessuti molli, osteomielite refrattaria, osteoradionecrosi, radionecrosi dei tessuti molli, danno tissutale tardivo da radiazioni, ulcere del piede diabetico, lembi e innesti compromessi e insufficienza arteriosa periferica acuta.

La qualità delle evidenze lungo questo elenco non è uniforme, e le revisioni Cochrane sono illuminanti nella loro precisione.

L’avvelenamento da CO rappresenta il trial singolo più solido. Weaver e colleghi hanno pubblicato nel 2002 sul New England Journal of Medicine un trial controllato randomizzato in doppio cieco, dimostrando che tre sessioni HBOT nelle 24 ore successive all’esposizione al CO riducevano del circa il 50% le sequele cognitive a sei settimane rispetto all’ossigeno normobaro.^[4] Il mascheramento era credibile: entrambi i gruppi indossavano maschere simili e respiravano attraverso apparecchi analoghi. Questo è il miglior trial della letteratura sull’HBOT.

Per le ulcere del piede diabetico, la revisione sistematica Cochrane del 2015 ha concluso che vi è «qualche beneficio» per la guarigione delle ferite e la riduzione del tasso di amputazioni maggiori, in particolare sulla base di tre trial randomizzati per un totale di circa 120 pazienti, ma ha valutato le evidenze come a bassa certezza a causa di campioni ridotti, limitazioni metodologiche ed eterogeneità clinica tra i tipi di ferite e le popolazioni di pazienti.^[5] Il segnale di beneficio è presente; la fiducia quantitativa è limitata.

Per il danno tissutale tardivo da radiazioni e l’osteoradionecrosi, la base di evidenze include diversi trial randomizzati con segnali di beneficio coerenti per gli endpoint di guarigione delle ferite, sebbene la maggior parte siano di piccole dimensioni. La razionale meccanicistica è solida: il tessuto danneggiato dalle radiazioni ha vascolarizzazione impoverita e limitata erogazione di ossigeno; ripristinare l’ossigeno disciolto aggira questa limitazione e sembra facilitare la sintesi del collagene e l’angiogenesi.

L’interpretazione pratica di questo livello: per le indicazioni consolidate, le evidenze cliniche giustificano la terapia a un livello che soddisfa i criteri standard della medicina basata sulle prove. Per alcune indicazioni questa giustificazione è robusta; per altre poggia su evidenze a bassa certezza che sono però ancora migliori di quelle disponibili per le affermazioni sulla longevità e sulla cognizione.

Livello 4: Le affermazioni sulla longevità e sulla cognizione

Questo è il livello più eccitante e quello da leggere con maggiore attenzione.

La logica biologica che collega l’HBOT a endpoint rilevanti per la longevità è coerente. Se l’HBOT mobilizza cellule staminali e progenitrici, upregola VEGF e promuove l’angiogenesi, e riduce l’infiammazione cronica attraverso effetti trascrizionali mediati da ROS, allora le conseguenze a valle potrebbero plausibilmente includere la riparazione tissutale, la clearance delle cellule senescenti e il mantenimento della funzione cognitiva nel tessuto che invecchia. Questa catena di ragionamento non è inventata; deriva dalla biologia della segnalazione del Livello 2.

Il problema è che «potrebbe plausibilmente derivare» non equivale a «è stato dimostrato che deriva in trial umani controllati». Ecco cosa dicono effettivamente le evidenze dei trial.

Allungamento dei telomeri e riduzione delle cellule senescenti. Hachmo e colleghi hanno pubblicato risultati su Aging (Albany NY) nel 2020, riportando che 60 sessioni HBOT nell’arco di 90 giorni producevano un aumento del 20-38% della lunghezza dei telomeri e una riduzione dell’11-37% dei linfociti T senescenti circolanti in una coorte di 35 adulti sani in età avanzata.^[6] Le dimensioni dell’effetto sono notevoli, maggiori di quelle riportate per la maggior parte degli interventi farmacologici o sullo stile di vita studiati in questo contesto. Le limitazioni sono altrettanto notevoli: nessun gruppo con sham-control, nessun mascheramento, singola coorte. Lo studio non è in grado di distinguere gli effetti dell’HBOT dalla regressione alla media, dagli effetti dell’aspettativa, dalla variazione stagionale o da qualsiasi altro fattore correlato al tempo. Il gruppo di ricerca è il Sagol Center for Hyperbaric Medicine and Research, affiliato ad Aviv Scientific, un fornitore commerciale di HBOT. La replica indipendente di questi specifici risultati non esiste a metà del 2026.

Guadagni cognitivi nell’invecchiamento sano. Lo stesso gruppo di ricerca ha pubblicato una serie di studi che mostrano miglioramenti nella velocità di elaborazione, nelle funzioni esecutive e nell’attenzione dopo HBOT in adulti oltre i 65 anni. Le dimensioni dei campioni dei singoli studi vanno da circa 35 a 73 partecipanti. La maggior parte è priva di controlli sham. I miglioramenti cognitivi, dove misurati rispetto alla baseline, sono statisticamente significativi, ma l’assenza di un gruppo di confronto adeguatamente controllato impedisce di separare l’effetto specifico dell’HBOT dagli effetti di apprendimento test-retest, che sono sostanziali nelle batterie di test cognitivi: i punteggi tendono a migliorare alla seconda somministrazione semplicemente per familiarità con il formato del test.

Neuroplasticità post-ictus e post-TBI. Efrati e colleghi hanno pubblicato su PLoS ONE nel 2013 risultati che mostravano miglioramenti della funzione neurologica in pazienti con ictus cronico, alcuni dei quali a distanza di anni dall’evento, dopo HBOT.^[7] Il meccanismo proposto, la riattivazione di neuroni «dormienti» nella zona di penombra attorno al tessuto infartuato, è biologicamente plausibile: il tessuto adiacente a un infarto può rimanere metabolicamente soppresso ma strutturalmente intatto per anni, e aumentare l’apporto di ossigeno potrebbe, in linea di principio, ripristinare parte della funzione. I trial sono piccoli e le evidenze sono preliminari; non costituiscono uno standard di cura. Sono in corso trial indipendenti su scala maggiore.

Fibromialgia. Efrati e colleghi hanno pubblicato su PLoS ONE nel 2015 i risultati di un trial crossover randomizzato su 60 pazienti con fibromialgia, comprendente un braccio sham-control con aria normobara.^[8] Il numero di tender point, le soglie del dolore e le misure di qualità della vita sono migliorati significativamente nel braccio HBOT. Questo studio ha una metodologia migliore rispetto ai trial sui telomeri e su quelli cognitivi: un disegno crossover con una condizione di controllo, anche se l’inertezza fisiologica del braccio sham a 1,3 ATA di aria è discutibile. È il trial HBOT con la metodologia più credibile tra quelli adiacenti alla longevità. La replica da parte di gruppi indipendenti non è ancora comparsa.

Il riassunto onesto di questo livello: gli effetti sono biologicamente plausibili, alcuni studi individuali mostrano risultati notevoli e i meccanismi del Livello 2 forniscono una razionale coerente per cui potrebbero esistere. Nessuno di questi esiti poggia però ancora su una base di trial sufficiente a definirli stabiliti. Sono ipotesi con segnali positivi preliminari.

Avvertenze: in primo piano, non in nota

Queste limitazioni non sono qualifiche periferiche a un caso altrimenti solido. Sono centrali per una valutazione accurata dello stato attuale del campo.

Il problema dello sham-control. I trial sull’HBOT affrontano una sfida di mascheramento intrinseca che la maggior parte dei trial farmacologici non ha. Entrare in una camera pressurizzata è un’esperienza sensoriale distintiva: le orecchie si tappano, l’aria ha una sensazione diversa, l’ambiente è inconfondibilmente insolito. I partecipanti agli studi non controllati sanno di ricevere il trattamento, e gli effetti dell’aspettativa sugli esiti soggettivi (dolore, qualità della vita, auto-segnalazione cognitiva) sono sostanziali. Alcuni trial usano una condizione sham a 1,3 ATA respirando aria arricchita o normale. Ma 1,3 ATA non è fisiologicamente inerte: aumenta l’ossigeno plasmatico disciolto rispetto alla baseline, e l’ossigeno disciolto a 1,3 ATA fornisce alcuni effetti di segnalazione, il che significa che il «placebo» non è un vero placebo. Senza uno sham credibile, la regressione alla media e l’aspettativa non possono essere escluse per qualsiasi esito auto-riferito o che migliori naturalmente nel tempo.

Conflitto di interessi. La proporzione di risultati positivi sull’HBOT per longevità e cognizione che provengono da un unico ecosistema è notevole e deve essere dichiarata apertamente. Shai Efrati, il Sagol Brain Institute presso lo Shamir Medical Center e Aviv Scientific, la rete commerciale di cliniche HBOT, rappresentano una quota sproporzionata dei risultati pubblicati su longevità e cognizione. Questo non rende falsi quei risultati. I ricercatori con un forte impegno personale e istituzionale verso un’ipotesi a volte producono effettivamente risultati positivi corretti. Ma la replica indipendente, da parte di ricercatori senza interessi finanziari o reputazionali nell’esito, è il meccanismo standard attraverso cui tali risultati vengono validati o rivisti. Questa replica non è ancora avvenuta su scala significativa per gli endpoint sulla longevità.

Eterogeneità di protocollo. «HBOT» non è una singola terapia. Lo spazio dei parametri comprende la pressione (da 1,3 a 2,5 ATA o superiore), la concentrazione di ossigeno (O2 al 100% vs. aria arricchita vs. aria ambiente), la durata della sessione (tipicamente 60-90 minuti), la frequenza delle sessioni e il numero totale (da 20 a 60 o più). I risultati di un protocollo non si trasferiscono a un altro. Lo specifico protocollo Efrati/Sagol per la longevità prevede 60 sessioni a 2 ATA, ossigeno al 100%, 90 minuti, con pause di cinque minuti di aria ogni 20 minuti. I dispositivi a camera morbida per consumatori a 1,3 ATA con aria ambiente sono un intervento fondamentalmente diverso: aumentano la pressione ambiente in modo modesto, non erogano ossigeno al 100% e l’incremento della PO2 plasmatica è minimo. Gli studi condotti a 2 ATA con O2 al 100% non validano l’esperienza delle camere morbide a 1,3 ATA con aria ambiente. La comunità degli sperimentatori n=1 sull’HBOT spesso utilizza protocolli il cui rapporto con qualsiasi protocollo studiato è poco chiaro.

La finestra ormetica. L’ossigeno è ormetico: benefico alla dose giusta e tossico al di sopra di essa. Gli stessi ROS che mediano la segnalazione benefica a concentrazioni moderate causano perossidazione lipidica, danno al DNA e ossidazione proteica a concentrazioni elevate. Due sindromi di tossicità specifiche sono clinicamente stabilite. La tossicità polmonare da ossigeno, l’effetto di Lorrain Smith, si sviluppa con l’esposizione prolungata a pressioni parziali di ossigeno elevate: i sintomi precoci includono irritazione tracheale e tosse, con danno alveolare a esposizioni più elevate o di maggiore durata. La tossicità del sistema nervoso centrale da ossigeno si manifesta come crisi epilettica tonico-clonica generalizzata e si verifica a pressioni parziali superiori a circa 1,6 ATA O2 nei soggetti suscettibili. I protocolli HBOT clinici sono progettati per rimanere all’interno della finestra terapeutica e sono supervisionati da personale addestrato proprio a causa di questi rischi. I dispositivi a camera morbida per consumatori a 1,3 ATA con aria ambiente non si avvicinano a questo profilo di rischio. L’HBOT clinico a 2,0-2,4 ATA sì, ed è per questo che viene erogato in ambienti clinici.

Affermazioni che eccedono le evidenze. Alcune formulazioni popolari dei benefici dell’HBOT non sono supportate dalla letteratura dei trial e meritano di essere segnalate. L’affermazione che l’HBOT produca «equilibrio ormonale» non è supportata da nessun RCT rigoroso. L’affermazione che produca «equilibrio dei neurotrasmettitori» è ugualmente priva di supporto a livello di trial clinici, sebbene esistano percorsi meccanicistici attraverso cui l’ossigenazione cerebrale potrebbe influenzare il metabolismo dei neurotrasmettitori. Queste affermazioni sono speculative. Potrebbero valere la pena di essere investigate, ma non vanno presentate come benefici stabiliti.

Cosa supportano effettivamente le evidenze

Un riassunto pratico, organizzato per livello di fiducia:

Alta fiducia, supporto RCT: Malattia da decompressione, avvelenamento da CO e embolia gassosa arteriosa, dove il meccanismo della legge di Henry è centrale e le evidenze cliniche sono solide. Osteoradionecrosi e danno tissutale tardivo da radiazioni, con segnali di beneficio coerenti tra più trial.

Fiducia moderata, segnale positivo con limiti metodologici: Ulcere del piede diabetico, dove le revisioni Cochrane trovano un beneficio ma valutano le evidenze come a bassa certezza. Ferite difficili e lembi compromessi, dove il beneficio è atteso biologicamente e osservato clinicamente, ma la qualità dei trial varia.

Segnale preliminare, replica indipendente assente: Allungamento dei telomeri, riduzione delle cellule senescenti, guadagni cognitivi nell’invecchiamento sano, neuroplasticità post-ictus e fibromialgia. Biologicamente plausibile, meccanisticamente supportato, risultati positivi pubblicati da un unico ecosistema, non ancora replicati in modo indipendente.

Non supportato: Affermazioni generali sull’equilibrio ormonale o dei neurotrasmettitori, affermazioni estrapolate da protocolli HBOT clinici a dispositivi a camera morbida per consumatori, e qualsiasi affermazione di beneficio stabilito sulla longevità.

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Il caricamento è fisica. La segnalazione è biologia reale. Le affermazioni sulla longevità e sulla cognizione sono biologicamente plausibili, ma poggiano su trial piccoli, per lo più non in cieco e spesso con conflitti di interessi. Questo non le rende necessariamente errate. Le rende una scommessa. Vale la pena seguirle, vale la pena testarle in modo n=1 rispetto a biomarcatori predefiniti; non vale ancora la pena trattarle come stabilite.

Riferimenti

1. Leach RM, Rees PJ, Wilmshurst P. (1998). Hyperbaric oxygen therapy. BMJ, 317(7166), 1140–1143. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9784458/
2. Thom SR, Bhopale VM, Velazquez OC, Goldstein LJ, Thom LH, Buerk DG. (2006). Stem cell mobilization by hyperbaric oxygen. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology, 290(4), H1378–H1386. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16299259/
3. Hadanny A, Efrati S. (2020). The hyperoxic-hypoxic paradox. Biomolecules, 10(6), 958. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32599875/
4. Weaver LK, Hopkins RO, Chan KJ, et al. (2002). Hyperbaric oxygen for acute carbon monoxide poisoning. New England Journal of Medicine, 347(14), 1057–1067. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12362006/
5. Kranke P, Bennett MH, Martyn-St James M, Schnabel A, Debus SE, Weibel S. (2015). Hyperbaric oxygen therapy for chronic wounds. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2015(6), CD004123. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26106870/
6. Hachmo Y, Hadanny A, Abu Hamed R, et al. (2020). Hyperbaric oxygen therapy increases telomere length and decreases immunosenescence in isolated blood cells: a prospective trial. Aging (Albany NY), 12(22), 22445–22456. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33206581/
7. Efrati S, Fishlev G, Bechor Y, et al. (2013). Hyperbaric oxygen induces late neuroplasticity in post stroke patients: randomized, prospective trial. PLoS ONE, 8(1), e53716. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23335971/
8. Efrati S, Golan H, Bechor Y, et al. (2015). Hyperbaric oxygen therapy can diminish fibromyalgia syndrome: prospective clinical trial. PLoS ONE, 10(5), e0127012. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25950267/